生态浮床修复铅污染废水中丛枝菌根真菌的功能及群落结构

近日，武汉理工大学土木工程与建筑学院徐舟影课题组在环境科学与生态学1区top期刊Science of the Total Environment上发表了题为“The function and community structure of arbuscular mycorrhizal fungi in ecological floating beds used for remediation of Pb contaminated wastewater”的研究论文。目前，环境中重金属离子（HMs）污染日益增加，寻找一种新的解决HMs污染的方法亟待解决。丛枝菌根真菌（AMF）已被证明在水生生态系统中普遍存在。然而，对其分布和生态功能的研究却很少。迄今为止，一些研究将污水处理设施与AMF结合以提高去除效率，但尚未探索合适的高耐受性AMF菌株，净化机制尚不清楚。生态浮床（EFBs）目前被广泛应用于处理各种污染水体，包括城市污水、污染地下水、雨水、酸性矿山废水、农业废水、污染河水和富营养水。然而，传统的EFB技术更多地依赖于植物和根际微生物对污染物的直接净化，很少关注植物共生微生物的协同净化。植物对HMs的去除效率较低，抗性较差，难以在高浓度HMs污染的水生环境中生存。本研究构建了3种不同接种菌剂的EFBs装置，通过考察其对铅（Pb）污染废水的去除效果，分析得出AMF能促进宿主植物生长，提高EFBs对Pb的去除效率。这些新发现为AMF在废水和受污染水体的植物生物修复中的应用提供了理论依据。

本研究构建了3种不同AMF接种（矿区AMF接种剂、商用AMF接种剂和非AMF接种剂）的EFB装置，考察其对Pb污染废水的去除效果。利用qRT-PCR和Illumina测序技术，对盆栽期、水培期和Pb胁迫水培期三个阶段美人蕉根系AMF群落结构的变化进行了跟踪研究。利用透射电子显微镜（TEM）和X射线能谱仪（EDS）检测了Pb在菌根结构中的位置。结果表明，AMF能促进宿主植物生长，提高EFBs对Pb的去除效率；AMF丰度越高，EFBs净化Pb的效果越好；淹水和Pb胁迫均降低了AMF多样性，但对其丰度抑制不显著；3种接种处理在不同时期表现出不同的群落结构和优势类群，Paraglomus sp. LC516188.1是Pb胁迫水培期的优势AMF（丰度占比为99.65%）。TEM和EDS分析结果表明，Paraglomus sp.可以通过其真菌结构（胞间菌丝、胞内菌丝等）在植物根系中积累Pb，减轻了Pb对植物细胞的毒性作用，限制了Pb的转运。

丛枝菌根真菌（AMF）是普遍存在的土壤微生物，可以与80%的维管植物物种形成共生关系，促进植物获得土壤矿质养分以换取碳化合物（糖和脂类）。大量研究证明AMF对宿主植物有积极作用，AMF促进植物生长，增加养分吸收，提高宿主植物的抗病性，在保护宿主植物抵御环境胁迫，如盐胁迫、有机污染物胁迫和重金属胁迫等方面发挥关键作用。一些研究将菌根与污水处理设施结合起来，如人工湿地（CWs）和生态浮床（EFBs）。将AMF应用于废水的植物-微生物联合修复中，获得了良好的处理效果。EFBs是一种生态废水处理系统，其中水生植被将其密集的根和根茎交织在一起，形成浮力过滤器，，有时由木筏或其他漂浮材料支撑。EFBs在根系网络和池底之间建立了一个水力梯度，并通过根系及其相关微生物群落的共同作用捕获、过滤和/或降解污染物。本文以不同来源的AMF与生态浮床共生系统为研究对象，考察其对Pb污染废水的处理效率，评估植物根系AMF群落结构从盆栽到水培再到Pb胁迫水培阶段的变化以及探索Pb胁迫下EFBs中AMF的生态功能。

注：表中数据为平均值±标准差，经Duncan多元极差检验(P < 0.05)，不同字母表示样本间差异显著。IM、IC和NI分别代表矿区AMF接种、商用AMF接种和未接种AMF的处理。Pb去除率是指各反应器对Pb污染废水中Pb的去除率。去除效率=(净化前的Pb浓度-净化后的Pb浓度)/净化前的Pb浓度。Pb去除量= EFB实验废水总量(160 L) ×(净化前的Pb浓度-净化后的Pb浓度)

根据形态学鉴定结果，AMF侵染率如附表S1所示，在盆栽阶段，IM(接种矿区AMF接种剂)、IC(接种商用AMF接种剂)和NI(不接种AMF)处理的F%分别为93.5%、100%和95.85%。IM、IC和NI处理的M%分别为34.75%、52.71%和51.24%，A%分别为0.72%、2.95%和1.17%。短期淹水后，3个处理的M%均有不同程度的下降（IM-A，31.33%；IC-A，16.38%；NI-A，25.94%）。F%和A%的数据也得到了类似的结果。Pb胁迫下，AMF在IM中的侵染率增加了36.05%，在IC中的侵染率增加了41.72%。然而，AMF在NI中的侵染率减少了15.08%。在水生或高Pb胁迫环境中，部分接种植株根系种仍能观察到囊泡、丛枝和菌丝结构。观察到的AMF结构的如图S2所示。使用qRT-PCR测定AMF侵染状态也得到了类似的结果(详见补充材料图S3)。

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不同 Pb 浓度下，不同接种处理的 EFBs 对 Pb 的去除效率      

     

如表1所示，在低浓度Pb (5 mg/L)胁迫下，经过30 d的净化试验，IM、IC和NI处理对废水中Pb的去除率分别为31.34%、24.41%和26.11%。同时，Pb的总去除量分别为235.20、182.40和196.80 mg。接种矿区AMF的美人蕉EFB(IM)对Pb的去除效果最好。与NI处理相比，Pb的去除率提高了20.16%。在高浓度Pb (45 mg/L)胁迫下，经过232 d的净化试验，IM、IC和NI处理对Pb的去除率分别为33.62%、30.80%和25.17%。同时，Pb的总去除量分别为2472.00、2278.00和1764.80 mg。IM处理对Pb的去除率最高，比NI处理的去除率高33.68%，IC处理比NI的去除率高22.47%。接种矿区AMF和商用AMF均显著提高了EFBs对高浓度Pb污染废水的长期去除效率（P < 0.05）。

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Pb 胁迫下美人蕉在不同 EFBs 中的生长指标      

     

如图1所示，在低浓度Pb（5 mg/L）胁迫31天和高浓度Pb（45 mg/L）胁迫211天后，与NI处理相比，IC处理的美人蕉的株高、根长、地径、地上部生物量和地下部生物量分别显著增加92.44%、14.54%、35.55%、139.74%和57.87%。同时，IM处理显著提高了美人蕉的植株生长指标，分别提高了55.36%、20.07%、20.38%、35.64%和34.34%。而IM和IC处理之间没有显著差异。

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不同 EFBs 美人蕉的 Pb 积累

     

     

4.1 美人蕉中 Pb 的积累

如表2所示，在Pb胁迫下长期淹水242 d后，不同组织(叶、茎、根系和根茎)的Pb浓度差异显著，其大小排列顺序为：根系>根茎>茎>叶。在NI处理下，美人蕉叶片、茎和根系的Pb浓度最高。与NI处理相比，IM和IC处理的叶片、茎和根系中Pb浓度显著降低，分别是NI处理的0.09、0.02和0.67倍，0.08、0.32和0.66倍。双因素方差分析结果表明，不同AMF接种和不同组织对美人蕉Pb浓度均有极显著影响(P < 0.001)，接种与组织的互作效应极显著(P < 0.001).

3个接种处理不同组织中Pb积累量大小顺序均为根茎>根系>茎>叶。与NI处理相比，IM和IC处理组中的美人蕉对Pb均显示出较低的生物富集系数和转移系数。如表2所示，两种AMF接种均增加了美人蕉根系和根茎中Pb的积累量，但降低了美人蕉叶和茎中Pb的积累量。IM处理的美人蕉根系和根茎Pb累积量分别比NI处理高12.59%和48.91%。叶片和茎的Pb累积量分别比NI低88.07%和33.96%。与NI相比，IC处理的根系和根茎Pb积累量分别增加了83.30%和8.93%。叶片和茎中Pb积累量分别减少了71.02%和92.20%。3个接种处理中，IM处理单株Pb积累量最高(133.22 mg/株)，IC处理次之(117.92 mg/株)，NI处理最低(109.62 mg/株)。

4.2 美人蕉菌根超微结构中 Pb 的定位

 

图2为在Pb胁迫下长期淹水242 d后，IM处理的美人蕉根尖伸长区和成熟区细胞的透射电镜图。从图3a和b中可以看出，美人蕉根尖的细胞结构出现了异常。细胞内普遍出现质壁分离现象，细胞膜断裂(箭头j)，细胞壁畸形且凸出(箭头k)，细胞器匮乏。图3c中可以观察到一个大液泡，中间带有许多疑似Pb的复合沉积物(箭头a所指的深色电子致密颗粒)。

如图2d所示，AMF胞间菌丝从细胞间隙穿过细胞壁和细胞膜进入细胞内部。在细胞间隙(箭头d)和胞间菌丝细胞内(箭头b和c)可见高密度的可疑Pb沉积。图2e、f和g显示了美人蕉根细胞中的AMF胞内菌丝，胞内菌丝的细胞壁和细胞膜状况良好。尽管看不到菌丝的细胞器，但仍然可见菌丝的细胞核结构（图2e）。图2g为根细胞内部的AMF胞内菌丝。箭头g所指的黑色颗粒疑似为菌丝内Pb沉积，箭头h所指的位置疑似为两胞内菌丝间隙中的Pb复合物沉积。利用能谱仪对图2中a、b、c、d、e、f、g、h箭头所示位置进行元素组成分析。EDS分析结果见补充材料中的表S3和图S3。

本研究共获得了1,048,535个序列。其中915,187个序列经过拼接、质量过滤、去重复、去嵌合体、聚类和去除singletons等步骤，保留用于后续分析。682,649条有效序列(占总序列数的65.1%，190个OTU)与MaarjAM和NCBI数据库中的球囊菌门SSU rRNA基因序列相匹配。其中，176个OTU在MaarjAM数据库中可以被分类为22个VT(表S4)，14个OTU在NCBI数据库中可以被分类为11个VT(表S5)。经测序检测到的33个VT分别属于Paraglomus (13)，Glomus (4)，Claroideoglomus (6)，Acaulospora (7)，Archaeospora(1)和未分类的Glomeromycota(2)。Krona物种组成图清晰展示了9个样本中丰度最高的AMF（图S5）。在9个样本中，Paraglomus(66%)是最优势属，其次是Claroideoglomus(16%)、Acaulospora(14%)、Glomus(4%)、未分类的Glomeromycota(0.9%)和Archaeospora(0.02%)。

根据图S6和S7所示的物种积累和稀疏曲线，随着样本和序列数量的增加，曲线达到渐近线，表明本研究的样本量是足够的。

6.1alpha 多样性指数

9 个样本的 alpha 多样性指数及相关分析见补充材料中表 S6 。

6.2 不同样本中的 AMF 群落结构

层次聚类分析结果如图3所示，IM_Pb、IC_Pb和NI_Pb样本间AMF群落结构存在极端相似性。样本IM_T和IC_A、样本NI_A和IM_A、样本NI_T和IC_T之间的AMF群落结构相似。

在盆栽阶段，三个接种处理组均表现出复杂的群落结构。样本IM_T中，Paraglomus为最优势属(75.33%)，Acaulospora为次优势属(11.52%)，其次为Glomus(9.84%)和Claroideoglomus(3.22%)。IC_T样本中，Paraglomus(54.60%)为最优势属，Glomus(24.16%)为次优势属，其次为Acaulospora(20.56%)、Claroideoglomus(0.34%)、未分类的Glomeromycota(0.33%)和Archaeospora(0.01%)。样本NI_T中，Paraglomus为最优势属(38.40%)，Acaulospora为次优势属(36.23%)。

淹水21 d后，3个接种处理(IM_A、IC_A和NI_A)的美人蕉根系AMF群落结构发生了显著变化。Glomus几乎不存在或只占很小的比例，不同处理表现出不同的群落结构特征。在IM_A样本中，Paraglomus的相对丰度没有保持以往的优势地位，而Acaulospora和Claroideoglomus的相对丰度较高。样本IC_A中，几乎整个AMF群落都属于Paraglomus（99.98%）。样本NI_A中，Claroideoglomus为最优势属(82.60%), Paraglomus为次优势属(17.36%)。

在Pb胁迫水培期的3个样本(IM_Pb、IC_Pb和NI_Pb)中，优势AMF属于Paraglomus属和Paraglomeraceae科，几乎主导了整个AMF群落 (99.83%、99.94%和92.00%)。类似的属水平上AMF群落结构分析结果见图S8。我们还绘制了Krona形式的多层饼状图，用于在种水平上清晰地描述IM接种处理在不同阶段AMF群落结构的演变(详见补充材料中的图S9)。

6.3 OTU-Venn 图

维恩图描述了IM、IC和NI处理在不同阶段的共同AMF OTUs，详见补充材料中的图S10。此外，为了找到淹水后IC处理组中AMF丰度和多样性快速下降的原因，我们追踪了IC处理在淹水后消失的OTUs。OTU维恩图(图S11)显示，IC处理组中的87个OTU在淹水后消失。其中，这87个OTU在IM_A和NI_A样本中分别仅剩5个和6个。似乎大多数AMF物种的消失是因为它们对水文条件的耐受性较低所致。

6.4 NMDS 分析

如图4所示，Stress值为0.05，说明本研究的NMDS分析结果相对可靠。置换多元方差分析结果显示，培养阶段对AMF群落的分类组成有显著影响(P = 0.003)。

NMDS分析表明，来自不同处理的9个样本在OTU水平上是相对离散的。在Pb胁迫的水培期中的3个样本(IM_Pb、IC_Pb和NI_Pb)之间存在显著的空间聚类。盆栽期和水培期样本间没有明显的聚类现象。此外，在OTU水平上，水培期样本的NMDS1值相对较高，其次是盆栽期和Pb胁迫水培期样本，盆栽期样本的NMDS2值较高。

6.5 OTU 和 VT 的变化

如表 S6 所示， 3 个处理组 (IM 、 IC 和 NI) 在盆栽阶段中均存在较多的 OTU(59 、 112 和 84) 和 VT(14 、 23 和 23) 。短期淹水 21 d 后， 3 个接种处理组的 OTU(29 、 31 和 27) 和 VT 数量 (9 、 12 和 12) 在迅速减少。 Pb 胁迫下长期淹水 242 d 后， OTU 数量分别减少到 15 、 11 和 7 个， VT 数量分别减少到 11 、 8 和 5 个。

6.6 分类丰度分布

9 个样本的分类丰度分布及相关分析见补充材料中的图 S12 。

AMF能促进宿主植物生长，提高EFBs对Pb的去除效率。淹水和Pb胁迫均未显著降低AMF丰度，但对AMF多样性有负面影响。这可能是由于某些特定的AMF物种对淹水和Pb胁迫的耐受性更高。在不同时期，三种接种处理的美人蕉根系AMF群落结构和优势菌株不同。水培期的优势AMF为Claroideoglomus etunicatum，未培养的Paraglomus sp. LC516188.1在Pb胁迫水培期的AMF群落中占主导地位，此外，这种来源于铅锌矿区的AMF种在菌丝表面、菌丝内部和菌丝间隙均积累了大量的Pb。AMF物种丰度越高，AMF对EFBs净化Pb的效果越好。预计AMF在净化污水和受污染水体中的应用将受到越来越多的关注。